重組蛋白廣泛用于生物學和醫學研究。由于可用于商業用途的簡單方法的發展，重組蛋白的表達變得越來越普遍。最重要的是，它極大地增加了可以進行結構和生化研究的蛋白質數量。由于每種蛋白質都是不同的，因此必須針對每種特定蛋白質開發純化方法和技術，同時牢記蛋白質的預期應用。
我們討論了影響的眾多參數蛋白質表達系統以及如何修改它們以提高它們在不同系統中的產量。
重組蛋白到底是什么？
重組蛋白被描述為“由重組DNA編碼的定制或修飾的蛋白"在合適的表達載體中編碼所需基因的質粒在特定的宿主表達系統中表達，以產生一定量的蛋白質用于科學研究、治療或診斷目的。
重組蛋白的大量應用包括如下:
產生重組蛋白需要將相關基因復制到表達載體中，同時受誘導型啟動子的調控。
然而，成功表達重組基因需要幾個變量，包括正確的蛋白質折疊、細胞生長性狀以及轉錄和翻譯水平的適當表達指標。在細菌表面展示重組蛋白在生物技術中有許多可能的用途；然而，這需要對通常在作為融合伴侶的載體蛋白上發現的靶向基序有更深入的理解。
此外，選擇表達系統需要了解開發、維持和其他經濟因素的成本。
用于生產重組蛋白的表達系統
基因工程已經使在細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物甚至動物體內生產有價值的重組蛋白成為可能植物細胞。這種生物技術已經廣泛應用于醫學，到2025年，其市場價值預計將達到4000億美元。
因為每種宿主細胞都是不一樣的，所以不同的蛋白質表達方法產生具有不同生物活性和穩定性水平的重組蛋白質并不罕見。糖蛋白包含超過50%的人類蛋白質和大約四分之一的工業重組藥物蛋白質。為了從這些重組蛋白中提取最多的蛋白質，通常需要真核細胞作為糖基化的宿主。
雖然大多數商業生物仿制藥是使用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞制造的，但治療性重組蛋白的表達受到動物宿主細胞易受反饋抑制的限制。此外，昂貴的血清或生長因子的高制造成本和流行的動物感染的生物安全問題促使科學家們尋求非動物來源的真核細胞表達方法。由于其有利的特征，包括低生產成本、高生物安全性和蛋白質后修飾特征，植物細胞是合成藥物重組蛋白的優選。
由于目前正在進行臨床研究的許多生物制藥蛋白質，如治療性蛋白質、抗原和抗體的有效表達，植物細胞表達系統已經獲得了國際關注。然而，細菌表達系統仍然是商業水平上的好系統。
細菌表達系統
說到生產重組蛋白，大腸桿菌是常見的來源之一。雖然大部分重組蛋白是在大腸桿菌的細胞質中產生的，但二硫鍵結合的重組蛋白經常是在周質中合成的。
氧化棲息地和駐留二硫鍵形成(Dsb)-系統可以通過將這些蛋白質導向周質來增強適當的二硫鍵。將周質用于具有二硫鍵的重組蛋白更好，但是穿過細胞質屏障的靶向問題會顯著降低周質產量。
讓我們看看涉及的因素和條件蛋白質表達優化在細菌蛋白質系統中。
蛋白質序列和基因對可溶性和表達的影響
導致異源蛋白質不表達的一個普遍因素是在感興趣的mRNA中存在“奇怪的"密碼子。有可能通過密碼子增強的基因生產來避免這種密碼子異常。基因合成的一個好處是，它讓你改變基因的密碼子偏好，以便更好地與雜交宿主合作。
用不常見的tRNAs加強的表達批次可以克服大腸桿菌重組基因中固有的密碼子異常。
表達產量和溶解度都受到靶結構域起始和末端殘基的影響。通過分析蛋白質的結構和功能，我們可以找到構建蛋白質結構域的最佳位置。通過將感興趣的蛋白質序列與同源蛋白質結構相匹配，有可能確定結構域結構未知的蛋白質的合適結構域邊界。如果你沒有獲得同源蛋白質復合物的途徑，你應該使用二級解剖部分的預測。
載體對溶解性和表達的影響
DNA序列的某些部分，如Shine-Dalgarno盒、啟動子、調控序列、轉錄終止子、復制源等，控制所需基因的翻譯和轉錄。此外，選擇元件被整合到表達載體中以促進質粒在靶細胞中的選擇。包含融合標簽是大腸桿菌表達載體的另一個基本部分。
當選擇啟動子框架時，應該考慮下游應用和蛋白質靶類型。當處理潛在有害的蛋白質時，選擇基礎輸出水平較低的啟動子系統是明智的。另一方面，為了盡可能提高蛋白質產量，必須選擇更有效的啟動子。對于易于聚集的蛋白質，可以考慮的一個選擇是使用冷休克啟動子，允許在較低的溫度下表達。
來自細菌和其他更大的生物的蛋白質通常折疊更長時間并粘在一起。在大腸桿菌中，折疊催化劑和蛋白質伴侶可以用來防止蛋白質粘在一起，同時使折疊更容易。兩種蛋白質，一種在靶質粒上編碼，另一種在獨立的質粒上編碼，可以共表達。
融合標簽在基因水平上附著在特定的蛋白質上，使它們更易溶解或更容易被發現和純化。你通常必須嘗試幾種不同的標簽，才能知道哪種融合標簽能產生最易溶解的蛋白質。此外，標簽的定位至關重要，它可以位于感興趣的蛋白質的C-末端或N-末端。大多數融合涉及N-末端，這種融合有一個優勢:與C-末端的對應蛋白相比，它通常提高了可溶性蛋白的表達。
考慮到融合標簽的可用性可能阻礙重組合成蛋白的生物學功能，在融合蛋白純化后酶促消除標簽可能是有用的。為了便于標簽的去除，建議整合一個對給定序列*特的蛋白酶的分割部分。
宿主原種對異源蛋白表達的影響
細菌變體宿主的發展可以促進異源蛋白質的合成。一些商業銷售的大腸桿菌變異體被改造成產生具有特定特征的蛋白質，例如那些易受蛋白水解、具有不尋常密碼子或需要二硫鍵的蛋白質。
蛋白酶缺陷型變體，如大腸桿菌BL21或該菌株的其他變體，被推薦用于易受蛋白水解破壞的蛋白質。當靶基因和表達宿主的密碼子頻率不同時，會發生氨基酸誤摻入、翻譯過早終止和翻譯停滯。如果不尋常的tRNAs在表達過程中被提供，這種差異將成為過去。使用具有編碼稀有tRNAs的質粒的細菌菌株，可以提高含有*特密碼子峰值頻率的基因的產量。
通過在包括谷胱甘肽還原酶(gor)和硫氧還蛋白還原酶(trxB)的宿主菌株中表達，可以提高含有二硫鍵的折疊蛋白的溶解性，并有助于胞質二硫鍵的產生。大腸桿菌周質氧化性很強，有利于二硫鍵的產生；在這種環境中靶向產生的蛋白質提供了表達含有二硫化物的蛋白質的替代技術。
通過調節表達增加蛋白質溶解度
使用有效的生產啟動子和高濃度的誘導劑可以在折疊前發生蛋白質聚集。如果轉錄和翻譯速率降低，新生成的蛋白質在聚集之前將有更多的時間折疊。為了提高蛋白質的溶解性，可以調整以下幾個典型方面的表達。
溫度:如果生產溫度降低到15-25 ℃,重組產生的蛋白質將更易溶解。降低的蛋白質收集、翻譯、轉錄和細胞分裂速率是由于在較低溫度下細胞過程變慢。當表達特定蛋白質的溫度降低時，易受蛋白水解影響的蛋白質的分解速度減慢。
引發劑的效力:重組蛋白的溶解性和活性可以通過降低轉錄速率來增強，這可以通過降低誘導劑的濃度來實現。
選擇的媒介:最重組蛋白生產通過分批培養來培養細胞。從一開始就將所有必需的營養物質加入到生長培養基中是至關重要的。
優化蛋白質的純化
- 固定化金屬親和色譜(IMAC)應該用作純化過程的第一階段。
- 當需要進一步純化時，使用凝膠過濾或尺寸排阻色譜法。必要時，離子交換色譜應該作為“純化"的最后一步
- 有可能刪除親和標簽以實現額外的純化并減少重組蛋白中存在的非原始序列的數量。
為大腸桿菌開發最佳表達系統
根據科學界目前的信息，建議開發一種適合大腸桿菌的表達系統是安全的。它應由促進有效轉錄、穩定轉錄物、使翻譯穩定、產生真正的重組蛋白而不被截短或延伸的變體污染、保持溶解性并聚集到總細胞蛋白的約20%的DNA成分組成。
這種類型的表達整合了管家啟動子s70所確認的共有啟動子，并且它可以通過整合UP元件而經歷額外的改善。誘導相鄰基因的通讀轉錄受到兩個缺乏任何因子的強轉錄終止子的串聯排列的阻礙。
在轉錄物兩端發現的反向重復穩定了轉錄物本身。這些重復序列可以產生莖環結構，阻礙5’端的核酸內切酶活性和3’端的核酸外切酶破壞，但它們不抑制翻譯。最后，彈性Shine-Dalgarno序列、下游8bp的AUG起始密碼子和延長的UAAU終止密碼子確保了有效的翻譯。折疊分子伴侶隨著新的多肽鏈同時表達，幫助它們折疊。
然而，有必要指出這樣一個結論，即所有的重組蛋白都沒有一種*美生產方法。每種蛋白質都有其挑戰。為了實現高度的合成，有必要通過系統地調整各種參數來優化每種情況下的工藝。
結論
出于生物技術、醫學和實驗目的，科學家采用許多策略來調節蛋白質的表達。與非常容易制造的DNA不同，蛋白質只能由細胞或活組織的復雜混合物制造。通過特定表達系統生產重組蛋白的努力可能會從令人滿意且相對快速的操作迅速轉變為緊張且耗時的過程。通過上述步驟，研究人員和科學家可以使用重組蛋白表達服務來克服這些障礙。
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